科普驿站 第三十七期
主题：核酸的剪刀——CRISPR-Cas系统
科目：生物
难度：B2
讲师：杜瑾鸿
CRISPR/Cas9：出道即巅峰
1953年，詹姆斯·杜威·沃森(James Dewey Watson,1928-)与弗朗西斯·哈里·康普顿·克里克(Francis Harry Compton Crick,1916-2004)提出了DNA的双螺旋结构，标志了分子生物学的诞生；1963年，约书亚·莱德伯格提出了在人体内引入基因的概念，并认为“这仅仅是个时间问题”；1978年，因发现“发现限制性内切酶及其在分子遗传学方面的应用”，沃纳·亚伯、丹尼斯·那森斯、汉密尔顿·史密斯分享了当年的诺贝尔生理学或医学奖。
基因工程(genetic engineering)并不是一个新鲜概念，甚至基因编辑(genome editing)也不是。在本文的主角——CRISPR/Cas9登场之前，我们就能在一定程度上修改基因。随着时间推移一些，还曾有过两种基因编辑的工具（并至今有应用），即锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，但因为商业和技术上的种种原因，它们的效率并不高。如果你读过其他关于CRISPR/Cas9的科普，就会知道Cas9是一种能够剪断DNA的酶。ZFN和TALEN同CRISPR/Cas9的一个本质区别是，前者依靠蛋白质与特定DNA结合来识别特定的序列；而CRISPR/Cas9靠的是一条RNA。正如我们从细菌中发现限制酶那样，CRISPR/Cas系统也自细菌中发现。
发现史
了解它的历史，能帮助我们理解它。1987年，石野良纯(石野 良純，Ishino Yoshizumi)等人在研究大肠杆菌的一个基因(iap)时，无意间发现了一段紧接着这个基因的“无法确定功能”的DNA（如图所示）。研究者注意到这段DNA同时具有如下特征，同时具有所有这些特征的DNA是以前的研究中从未发现的：
引自Ishino Y , Shinagawa H , Makino K , et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product.[J]. Journal of Bacteriology, 1987, 169(12):5429-5433.
1.这段DNA中的一些小片段具有几乎相同的碱基排列方式（其中一条链是CGGTTTATCCCCGCTRRCGCGGGGAACTC）。但它们并不首尾相接，而是被另外一些排列方式多变的DNA隔开，就好像是准备好很多条相同的小段，然后把它们均匀地插入了一段杂乱排列的DNA一样。这些序列称为重复序列(repeat)，而把它们隔开的杂乱排列的DNA称为间隔序列(spacer)。
2.一段重复序列有29个碱基，而将它们隔开的间隔序列虽然杂乱多变，但每一段一定有32个碱基。
3.一段重复序列中有部分片段是反向互补的。比如在上图中，被下划线的部分——TCCCCGC和GCGGGGA，写出前者的反向排列（即CGCCCCT），发现它可以与GCGGGGA恰好互补，反之亦然。
这种DNA并没有立即得名，或者说只是因为类似的结构在很多细菌中被发现，而随便取了几个名字(如DR:direct repeat；TREP:tandem repeat；SRSR:short regularly spaced repeats)。然而，1989年，中田敦夫(中田 敦夫，Atsuo Nakata)、牧野公三(マキノ 公三，Kozo Makino)等人在另外两种品系的大肠杆菌，以及另外两种细菌——痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、肠志贺氏菌(S. enterica)中再次发现了相同特征的DNA片段；1991年，彼得·赫曼斯(Peter W.M.Hermans)等人在结核分歧杆菌(Mycobacterium tuberculosis)等放线菌门(phylum Actinobacteria)成员中又发现了此类DNA；1993年，这样的DNA首次发现在古细菌——地中海嗜盐菌(Haloferax mediterranei)中。随着时间推移，科学家在越来越多的原核物种中发现了这样的DNA。到2000年，科学家确定这种序列在40%左右的真细菌和90%左右的古细菌中的存在。而且还发现在不同的细菌中，乃至在同一种细菌的不同CRISPR中，人们发现重复序列和间隔序列的排列方式、重复序列重复出现的次数都可以表现出很大差异。
真细菌界与古细菌界：把真细菌等同于真菌是一个误区。20世纪最伟大的生物学家之一——Carl Woese就细菌中发现的两类已涉及到根本性的差别——如转录因子、rRNA、tRNA的类别差异——的类群提出，应该将细菌进一步分为真细菌(Eubactria)界和古细菌(Archeobacteria或者Archaea)界。古细菌经常生活在一些极端环境，如高温、高盐的环境中，这让一些人不禁猜测古细菌可能是最原始且占优势的生命体形式。
为此，2002年，吕德·詹森(Ruud Jansen)将具有以上特征的DNA片段重新命名为CRISPR。也就是说，CRISPR，也即clustered regularly interspaced short palindromic repeats——“成簇规律性间隔短回文重复序列”，是DNA。
不过，科学家依旧迟迟无法确定它的作用，这让科学家更加好奇了。
与此同时，随着测序技术的发展，科学家逐渐获得了更多细菌的基因组数据。通过比较大批细菌的基因文库，人们发现了总位于CRISPR附近的一些基因，在不同的菌种之间普遍相似。科学家最初鉴定出了4种这样的基因。这些基因被詹森命名为CRISPR-associated sequence即Cas。这4种基因分别称为Cas1-4。詹森指出：在大多数含有这4种基因的细菌中，人们发现它们在基因组中的排列顺序是Cas3-Cas4-Cas1-Cas2，换言之就是一个操纵子，CRISPR则位于这个“基因簇”的某一侧。此外，对于掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)等含有两个或多个CRISPR的细菌来说，在相同的细菌中，不同的CRISPR可能伴随有排列方式不同的Cas基因簇，比如下图所示的细菌。图示取自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，这是一种乳酸菌。
引自Horvath P , Barrangou R . CRISPR/Cas, the Immune System of Bacteria and Archaea[J]. Science, 2010, 327(5962):167-170.
同时，在2002年的同一篇论文里，詹森还指出，Cas1和Cas2蛋白的功能无法确定，而Cas3具有解旋酶的活性；Cas4的功能则似乎与核酸外切酶相似。
这样的发现，能给我们推断它的功能带来什么用处呢？
起初人们根据Cas蛋白的功能猜测CRISPR/Cas构成了一个DNA修复系统，或者跟代谢、重组、抗高温等有关。不过有意思的是，2005年，弗朗西斯科·莫吉卡(Francisco J.M.Mojica)和克里斯汀·波塞尔(Christine Pourcel)分别独立发现间隔序列的碱基排列方式与一些噬菌体或质粒的DNA片段几乎完全相同，引发了“CRISPR与抵抗外来因子有关”的猜测，他们的研究指出，噬菌体和质粒似乎无法侵染在CRISPR有一段DNA，其排列方式与它们的某段DNA相同的细菌。除了猜测CRISPR的抵抗作用以外，他们也同时认为一定存在某种机制能够使CRISPR将入侵的DNA的关键信息记录下来。同年，亚历山大·波罗金(Alexander Bolotin)同时发现记录的噬菌体的信息越多，对噬菌体的抵抗能力就越强。已经可以说是有大量研究表明，CRISPR/Cas的存在跟细菌的获得性免疫有关。但是这些研究仍然没有引起广泛重视。2006年，基拉·马卡洛娃(Kira S.Makarova)提出并强调Cas蛋白其实是细菌获得性免疫的效应物，并提出：CRISPR/Cas“与脊椎动物的获得性免疫极为相似”。（他而且地根据CRISPR/Cas在古细菌中更加普遍的存在略为激进地推断，这种系统进化上很可能在古细菌中率先产生，然后才通过细菌间遗传物质的共享转移到了真细菌中。）
外切酶与内切酶的区别：外切酶是能够从多聚核苷酸链的末端开始水解核酸的核酸酶；内切酶是能够从多聚核苷酸链的中间开始水解核酸的核酸酶。
2007年，鲁道夫·巴兰戈(Rodolphe Barrangou)用嗜热链球菌做了一系列实验：在它的CRISPR的间隔序列中插入一些某种噬菌体的DNA，结果发现嗜热链球菌对这种噬菌体产生抵抗性；删除噬菌体基因组中，排列方式与细菌的间隔序列相同的DNA，结果发现细菌对该噬菌体失去免疫能力；这样证实了CRISPR发挥获得性免疫的作用的猜想。他们还发现CRISPR也能干扰质粒的转移。次年，约翰·范德奥斯特(John van der Oost)又证实了，CRISPR可以转录出一些特殊的RNA，这些RNA与Cas蛋白质结合成“核酸-蛋白复合体”，以此来发挥功能。实验证据和观测证据在这段时间里越来越多。最终，人们从而确切地知道了CRISPR/Cas系统。再后来，人们陆续发现了CRISPR/Cas9作用的完整的分子生物学机制，从而发现并挖掘了它改造为基因编辑工具的巨大潜力。
延伸阅读：History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology，这篇文章的作者之一是CRISPR的发现者之一石野良纯。本表根据该文及鲁道夫·巴兰戈与约翰·范德奥斯特所编CRISPR-Cas Systems:RNA-Mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea、鲁凤民等《CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术》、周诺等《CRISPR/Cas9基因编辑系统的发展及其在医学研究领域的应用》及诸文献汇编而来。
我们下期继续介绍。
参考资料：
Haft D H , Selengut J , Mongodin E F , et al. A Guild of 45 CRISPR-Associated (Cas) Protein Families and Multiple CRISPR/Cas Subtypes Exist in Prokaryotic Genomes[J]. PLoS Computational Biology, 2005, 1(6):e60.
Makarova K S , Haft D H , Barrangou R , et al. Evolution and classification of the CRISPR–Cas systems[J]. Nature Reviews Microbiology, 2011, 9(6):467-477.
在2005年的研究中，科学家首次为Cas蛋白做了分类，将45种蛋白归入鉴定出的10个亚型：核心蛋白(core proteins)、Ecoli亚型、Ypest亚型、Nmeni亚型、Dvulg亚型、Tneap亚型、Hmari亚型、Apern亚型、Mtube亚型、RAMP组件一共十个家族中。
Ecoli亚型(cse)来源于一个大肠杆菌品系：Escherichia coli K12-MG1655。
Ypest亚型(csy)来源于多个鼠疫耶尔森菌耶尔森菌(Yersinia pestis)品系。
Nmeni亚型(csn)来源于一个脑膜炎奈瑟氏球菌品系：Neisseria meningitidis Serogroup A Z2491。
Dvulg亚型(csd)来源于希尔登堡脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris Hildenborough)。
Tneap亚型(cst)来源于一个新阿波罗栖热袍菌品系：Thermotoga neapolitana DSM4359。
Hmari亚型(csh)来源于一个死海盐盒菌品系：Haloarcula marismortui ATCC 43049。
Apern亚型(csa)来源于一个敏捷气热菌品系：Aeropyrum pernix K1。
Mtube亚型(csm)来源于两个结核分枝杆菌品系：Mycobacterium tuberculosis CDC1551和H37Rv。
RAMP组件(RAMP module)亚型(cmr)是一个特殊的Cas蛋白家族。
虽然在2011年进行了重新分类，但是很多蛋白根据该分类方法所赋予的名称代号却被沿用了下来，但也有很多蛋白的名字被更改。如Cas9曾被称作Csn1或Csx12。更多详细的资料可参见TIGRFAMs(http://www.jcvi.org/cgi-bin/tigrfams/index.cgi)。
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